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摘要
本发明公开了一种产纤维素酶的甘草内生菌及其所产酶在提取甘草中甘草酸的应用，所述甘草内生菌为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum，保藏号为CGMCCNo:16968，其所产纤维素酶可用于甘草中甘草酸的提取。本发明将内生菌所产专属性纤维素酶应用于提取甘草中甘草酸，可使甘草酸更好地从甘草中溶出，从而使甘草酸得率提高34%。
权利要求
1.一种产纤维素酶的甘草内生菌，其特征在于：所述甘草内生菌为G-0.5-1菌株，为尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum，保藏号为CGMCC No:16968。
2.如权利要求1所述的甘草内生菌，其特征在于：所述菌株的18S rDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.如权利要求1所述的甘草内生菌的应用，其特征在于：其所产纤维素酶可用于甘草中甘草酸的提取。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：称取甘草粉末50g，按照30U/g加入G-0.5-1粗酶液，再加水至150ml，于37℃下放入摇床中酶解22h后，加70%氨性乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5h，料液比1：7，合并提取液浓缩至150ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，7000r/min冷冻离心15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥，即得粗品，高效液相色谱检测粗品中甘草酸含量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述G-0.5-1粗酶液通过以下方法制备所得：将G-0.5-1菌株划线到马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA培养基上，于28℃培养3-4d，直到长成明显菌落；然后用接种环挑取少许有孢子的菌丝接种到含50 mL PDA发酵培养基的500 m L三角瓶中，于28℃，180 r/min振荡培养7-10d得到发酵液，5000 r/min离心30min，收集上清液即为粗酶液。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述氨性乙醇溶液的体积浓度为70%，其含有
0.5%的氨水。
说明书
产纤维素酶的甘草内生菌及其所产酶在提取甘草中甘草酸的
应用技术领域
[0001]本发明涉及中药有效成分提取领域，具体涉及一种产纤维素酶的甘草内生菌及其所产酶在提取甘草中甘草酸的应用。
背景技术
[0002]甘草酸(Glyrrhizicacid)又称甘草皂苷、甘草甜素，是从甘草(Glycyrrhiza uralensis fisch)干燥根及根茎中提取的三萜皂苷类化合物，为白色或淡黄色结晶型粉末， 有特殊甜味，分子式：C42H62O16，分子量：822.92，易溶于热水及乙醇，几乎不溶于乙醚。甘草酸是主要由中药甘草中提取的一个活性成分，具有抗肝中毒、降低丙谷转氨酶、恢复肝细胞功能、防止脂肪性变，促进胆色素代谢和退黄及解毒作用，减少胶原纤维增生，防止肝硬化等作用。以甘草酸为活性成分基础，一般多以其盐的形式被广泛应用于医药行业，比如甘草酸单铵盐、甘草酸二铵盐、甘草酸钠盐以及钾盐等等，是一种重要的医药中间体，也用作为食品添加剂。
[0003]甘草中提取甘草酸的方法多有报道。其中传统方法包括水煎法和稀氨水提取法，但这些提取方法明显存在提取产率不高等突出问题。随着医药装备制造业的高蓬发展，也有一些提取辅助设备被应用到甘草的提取中，如超声提取、红外提取、过热水提取等。然而，这些通过改良设备的方法对甘草有效成分的提取改善有限，而且设备投入高，也一定程度上限制了其进一步的使用。
[0004]植物细胞壁中含有大量纤维素，通过纤维素酶降解植物细胞壁是增加中药有效成分溶出，是利用生物酶辅助提取中药有效成分方法建立的依据。酶法作为一种新型提取方法，主要是利用酶反应的专一性和高效性，具有条件温和、提取效率高、绿色节能等特点。然而应用纤维素酶辅助提取甘草的有效成分的研究，目前文献还报道不多，已有的通过普通市售纤维素酶应用于提取甘草中甘草酸的结果显示其专一性低，提取效果差，不能满足应用要求。
发明内容
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种应用甘草内生菌所产纤维素酶提取甘草中甘草酸的新方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种产纤维素酶的甘草内生菌，所述甘草内生菌为G-0.5-1菌株，为尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum，已于2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），菌种保藏号为：CGMCC No:16968。
[0007]所述菌株的18S rDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008]所述的甘草内生菌所产纤维素酶可用于甘草中甘草酸的提取，包括如下步骤：所述甘草中甘草酸的提取通过以下方法进行：称取甘草粉末50g，按照30U/g加入G-0.5-1粗酶液，再加水至150ml，于37℃下放入摇床中酶解22h后，加70%氨性乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5h，料液比1：7，合并提取液浓缩至150ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，7000r/min冷冻离心15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥，即得粗品，高效液相色谱检测粗品中甘草酸含量。
[0009]进一步地， 所述G-0.5-1粗酶液通过以下方法制备所得：将G-0.5-1菌株划线到马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上，于28℃培养3-4d，直到长成明显菌落；然后用接种环挑取少许有孢子的菌丝接种到含50 mL PDA发酵培养基的500 m L三角瓶中，于28℃，180 r/min振荡培养7-10d得到发酵液，5000 r/min离心30min，收集上清液即为粗酶液。进一步地，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA的制备方法为：称取去皮马铃薯200g，切块后加适量水煮沸30min，用8层纱布将煮好的马铃薯汁过滤，滤液加蒸馏水定容至1000mL，加入葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，充分溶解后，121℃高压灭菌20min，分装，备用。
[0010]进一步地，所述氨性乙醇溶液的体积浓度为70%，其含有0.5%的氨水。
[0011]本发明将内生菌所产专属性纤维素酶应用于提取甘草中甘草酸，可使甘草酸更好地从甘草中溶出，从而使甘草酸得率提高34%。
附图说明
[0012]图1为甘草酸标准品含量的HPLC法测定色谱图。
[0013]图2为菌株G-0.5-1产酶辅助提取甘草酸含量的HPLC法测定色谱图。
[0014]图3为本发明实施例1中不同醇含量对提取甘草酸量的影响示意图。
[0015]图4为本发明实施例1中不同提取时间对甘草酸量的影响示意图。
[0016]图5为本发明实施例1中不同提取料液比对甘草酸量的影响示意图。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0018]以下实施例中所使用的甘草购自甘肃兰州黄河药材市场；G-0.5-1菌株保存于兰州理工大学微生物实验室内；该菌株同时保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）；所使用的乙醇，氨水，蒸馏水，浓硫酸，葡萄糖等均为化学纯，由市场购入。
[0019]实施例1G-0.5-1粗酶液的制备将G-0.5-1菌株划线到马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上，于28℃培养3-4d，直到长成明显菌落；然后用接种环挑取少许有孢子的菌丝接种到含50 mL PDA发酵液体培养基的500 m L三角瓶中，于28℃，180 r/min振荡培养7-10d得到发酵液，5000 r/min离心30min，收集上清液即为粗酶液。
[0020]酶处理提取甘草中甘草酸的工艺优化（1）不同醇含量对提取甘草酸量的影响称取5份后甘草粉末5g，按照30U/g加入G-0.5-1粗酶液，再加水至15ml，于37℃下放入摇床中酶解22h后，将醇含量设为5个梯度，分别为（10%、30%、50%、70%、90%），进行回流提取，提取3次，每次一小时，料液比1：7，合并提取液浓缩至50ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，7000r/min冷冻离心15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥，即得粗品。平行三次，取平均值，所得结果如图实例1A；发现醇含量为70%时提取效果最好。
[0021]（2）不同提取时间对甘草酸量的影响称取5份后甘草粉末5g，按照30U/g加入G-0.5-1粗酶液，再加水至15ml，于37℃下放入摇床中酶解22h后，于70%乙醇中进行回流提取，将提取时间设为5个梯度，分别为（3.5h、4h、
4.5h、5h、5.5h），进行回流提取，提取3次，料液比1：7，合并提取液浓缩至50ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，7000r/min冷冻离心15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥，即得粗品。平行三次，取平均值，所得结果如图实例1B，发现提取时间为4.5h时提取效果最好。
[0022]（3）不同提取料液比对甘草酸量的影响称取5份后甘草粉末5g，按照30U/g加入G-0.5-1粗酶液，再加水至15ml，于37℃下放入摇床中酶解22h后，分别设置料液比1：5,1：6,1：7,1:8，1：9。于70℃下回流提取1.5小时，提取液浓缩至10ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，7000r/min冷冻离心15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥，即得粗品。平行三次，取平均值，所得结果如图实例1C，发现提取料液比为1:7时提取效果最好。
[0023]综合考虑工艺经济和对环境的影响，确定提取时间为4.5h,提取时溶剂中乙醇含量为70%，提取料液比为1:7时，为最佳提取工艺。
[0024]实施例2G-0.5-1粗酶液的制备将G-0.5-1菌株划线到马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上，于28℃培养3-4d，直到长成明显菌落；然后用接种环挑取少许有孢子的菌丝接种到含50 mL PDA发酵培养基的500 m L三角瓶中，于28℃，180 r/min振荡培养7-10d得到发酵液，5000 r/min离心30min，收集上清液即为粗酶液。
[0025]常规水提取（不加酶提取）甘草中甘草酸称取甘草粉末50g，加水150ml，于37℃下放入摇床中处理22h,加氨性乙醇溶液（0.5%氨水、70%乙醇），回流提取3次（每次1.5h，料液比1：7），提取液浓缩至150ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，冷冻离心（7000r/min）15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥并称重。结果得到粗品9.62g。
[0026]市售纤维素酶提取甘草中甘草酸称取甘草粉末50g，将市售纤维素酶液测定酶活后按照30U/g加入甘草粉中，加水至150ml，于37℃下放入摇床中酶解22h,加氨性乙醇溶液（0.5%氨水、70%乙醇），回流提取3次（每次1.5h,料液比1：7），提取液浓缩至150ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，冷冻离心（7000r/min）15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥并称重。结果得到粗品9.75g。
[0027]菌株G-0.5-1所产纤维素酶提取甘草中甘草酸称取甘草粉末50g，将G-0.5-1粗酶液测定酶活后按照30U/g加入甘草粉中，加水至150ml，于37℃下放入摇床中酶解22h,加氨性乙醇溶液（0.5%氨水、70%乙醇），回流提取3次（每次1.5h,料液比1：7），提取液浓缩至150ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，冷冻离心（7000r/min）15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥并称重。结果得到粗品11.57g。
[0028]HPLC检测甘草酸含量高效液相色谱（HPLC）条件包括：色谱柱，Agilent Zorbax ODS3- C18(250×4.6mm,5um)；流动相，甲醇-水（4：6）或2%冰醋酸（v/v）；体积流量，0.4ml/min；检测波长，237/254nm；温度，30℃；样品浓度，1ml/min。
[0029]经过检测后甘草酸含量分别是：36.0103%，35.6015%和40.1021%；计算发现，相较水处理提取，市售纤维素酶处理后提取的甘草酸量无明显增高，G-0.5-1菌所产纤维素酶处理提取得到的甘草酸量提升了34%，详细结果如表1所述。
[0030]实施例3G-0.5-1粗酶液的制备将G-0.5-1菌株划线到马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上，于28℃培养3-4d，直到长成明显菌落；然后用接种环挑取少许有孢子的菌丝接种到含50 mL PDA发酵培养基的500 m L三角瓶中，于28℃，180 r/min振荡培养7-10d得到发酵液，5000 r/min离心30min，收集上清液即为粗酶液。
[0031]菌株G-0.5-1所产纤维素酶提取甘草中甘草酸称取甘草粉末50g，将G-0.5-1粗酶液测定酶活后按照30U/g加入甘草粉中，加水至150ml，于37℃下放入摇床中酶解22h，加氨性乙醇溶液（0.5%氨水、70%乙醇），回流提取3次（每次1.5h,料液比1：7），提取液浓缩至150ml，滴加浓硫酸，边加边搅拌，至不产生沉淀，测其pH值为1至2，冷冻离心（7000r/min）15min，所得沉淀用水洗涤两次，于60℃的烘箱中干燥并称重。结果得到粗品11.74g。
[0032]HPLC测定甘草酸含量高效液相色谱（HPLC）条件包括：色谱柱，Agilent Zorbax ODS3-C18(250×4.6mm,5um)；流动相，甲醇-水（4：6）或2%冰醋酸（v/v）；体积流量，0.4ml/min；检测波长，237/254nm；温度，30℃；样品浓度，1ml/min。
[0033]经过检测后甘草酸含量是39.6416 %，较实施例2中水提取，提取率提升了34.37%。
[0034]本发明将内生菌所产专属性纤维素酶应用于提取甘草中甘草酸，可使甘草中甘草酸更好地溶出，并提高甘草酸的提取率。确定提取时间为4.5h,提取时溶剂中乙醇含量为70%，提取料液比为1:7时，为最佳提取工艺。市售纤维素酶和水对甘草中甘草酸的提取并不产生作用，从本实验中得到特异性菌株G-0.5-1发酵所产生的酶对甘草酸的提取有明显的促进作用，可以使甘草酸得率提高34%。
[0035]表1不同方法提取甘草中甘草酸的比较样品处理 粗品量/g 粗品含量/% 甘草酸量/g 与水处理比较提取率提升水处理 9.62g 36.0103% 3.4635g /市售纤维素酶处理 9.75g 35.6015% 3.4711 0.22%G-0.5-1处理 11.57g 40.1021% 4.6411 34%以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
